一、关于生化检测
（1）生化检测介绍生化检测是在研究生物健康和疾病的生物化学过程变化的基础上，利用物理学、化学、生物学、病理学、免疫学、生物化学的理论与技术，通过检测生物血液、尿液、脑脊液等样本中化学物质的量与质的变化，为研究者提供疾病诊断、病情监测、疗效观察、判断预后以及健康评价等信息，最终判断被检者是否存在潜在疾病或排除某些疾病、揭示疾病变化以及药物治疗对机体生物化学过程影响的一门技术手段。
（2）生化检测原理朗伯—比尔定律待测物质溶液(均匀非散射)在一定浓度范围内对一定波长的单色平行光的吸光度与被测物质浓度和溶液厚度成正比。数学式为：A= εCLA为吸光度，C浓度，L为光径， ε为摩尔吸光系数，单位是L/mol∙cm。
朗伯比尔定律的应用需要满足几个条件：① 光线为平行光；② 光线为单色光；③ 溶液介质均匀。
生化仪器的分析方法
① 终点法：被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的变化求出被测物浓度，称为终点法。
② 两点法：在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，测定单位时间内两点的吸光度的变化率。有时也称此法为固定时间法。
③ 动力学法：一般用于酶活力的测定，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化情况，在反应速度恒定的情况下，以单位时间酶反应初速度来计算酶的活力单位。此法测酶的活力而不是酶的浓度（质量）。
二、生化检测前准备工作
（1）样本类型血清、血浆、尿液、脑脊液、全血、组织上清。
① 全血：包括血细胞和血浆的所有成分。采集全血时，收集管中必须含有抗凝剂。常用的抗凝剂有：肝素、柠檬酸钠和乙二胺乙酸酸 (EDTA)。根据不同研究需要进行选择。
② 血浆：是全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，获得的不含细胞成分的液体。含有纤维蛋白原、凝血因子等。
③ 血清：是全血未经过抗凝处理，血凝块聚缩释出的液体。其中没有纤维蛋白原和凝血因子。
收集全血于不含抗凝剂or含促凝剂的血液收集管中；室温/4℃让样本自然凝血30-60 min，期间不能摇晃或震动；4℃，2000~3000 rpm离心10 -15min。
（2）动物采血注意事项
① 小鼠的循环血量大约是72ml/kg。以25g的成年小鼠为例，它的循环血量大约为1.8ml。
② 大鼠的循环血量大约是64ml/kg。以250g的成年大鼠为例，它的循环血量大约为16ml。
③ 采集10%的循环血量之后，大约需要2周时间恢复。
④ 状况良好的小鼠一般采血量建议不超过循环血量的10%。有研究表明失血超过15%以上实验动物会发生血量减少性休克。以25g的成年小鼠为例，10%的循环血量大约是0.2ml。
（3）不同采血管的应用
（4）生化检测送样检测注意事项
1. 血常规检测（检测量全血20ul，客户准备全血50ul）
① 最好使用EDTA抗凝血剂；
② 柠檬酸盐将稀释样本，肝素将引起细胞凝集，两者都将减少计数。
2. 生化检测（检测量血清10ul/指标，客户准备血清30+（n-1）*10ul）
① 肝素化血浆或血清(无抗凝血剂)样品适用于生化检测。因为同一患者的血浆与血清的检测结果不同。所以如果需要连续监测同一患者，应使用相同的样品。血浆里含有纤维蛋白原，而血清中没有(在凝血期间移除)，因此检测结果里血浆的总蛋白(和球蛋白，因为纤维蛋白原是β球蛋白)的结果比血清高。凝血期间钾从血小板中释放，因此血清钾高于血浆钾(后者结果更准确)。
② 柠檬酸盐和EDTA抗凝剂不适用于生化检测，因为它们会螯合二价阳离子(钙，镁)并含有高浓度的钠(柠檬酸盐)或钾(EDTA)。即使是在轻度EDTA污染的血液样品中进行生化检测都会出现超高钾和超低钙的结果。一些酶的活性也需要二价阳离子。因此，在含有EDTA或柠檬酸盐做抗凝剂的血浆中，这些酶(例如碱性磷酸酶)的检查结果会虚假偏低。
3. 凝血四项（检测量血浆100ul/指标，客户准备血浆100ul/指标或全血2ml）
① 最好使用枸橼酸钠(对钙有轻度螯合作用，因此钙可以回到样本中以进行凝血筛选测定)。
② 不能使用肝素(样品不会凝结)，EDTA可以使用(钙可以回到样本中)，但不是很可靠所以不推荐使用。
（5）不同样本采集及送样要求
1. 样本采集
① 全血：取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中，轻轻颠倒混匀，充分抗凝，得到全血样本。
② 血清：取新鲜血液置于普通，室温条件下静置30 min，待血液凝结，2000rpm离心10 min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。
③ 血浆：取新鲜血液加入到盛有肝素化抗凝剂的管中，颠倒混匀，充分抗凝，1000-2000rpm离心10 min，取上层淡黄色透明液体即为血浆
2. 样本保存及运输
① 全血：血常规检测应尽量在血液采集后2h内完成，如全血标本未来得及送检，需要将标本放置于4℃以下保存一天内检测；糖化血糖蛋白检测：当天完成避免过夜；4℃运输，将样本用纸包裹起来避免直接与冰袋接触；
② 血清、血浆：生化检测尽快完成，若暂时不测定，可分装冻存备用，避免反复冻融，一般4℃可保存一周，-20℃可保存半个月，-80℃可保存一个月。特殊指标对样本有较高要求除外。4度运输；干冰运输（切记反复冻融）；
3. 凝血四项样本采集及送样要求
① 样本采集：抽取静脉血，按照9份静脉血、1份抗凝剂的比例加入到3.8%(或3.2%)的枸橼酸钠抗凝管中，轻轻颠倒10次使之充分混匀，不得有凝块，不得形成泡沫。（蓝色管）
② 样本处理：采样后应尽快分离血浆(60分钟内进行)，将标本以3000r/min离心10-15分钟，使血浆分层，取上层血浆。
③ 样本保存及运输：分离后的血浆-20℃以下密封可保存2周。干冰运输。
④ 样本用量：凝血四项单次检测样本量不可低于300ul，单项检测最好提供100ul以上，样本不可稀释。
三、生化检测结果异常分析
（1）溶血对生化检测结果的影响
1. 干扰机制
由于RBC内高浓度成分逸出，增加血浆分析物浓度；血红蛋白（Hb）浓度升高导致的光学干扰，还可以使431～555 nm波长附近的吸光度（A）值明显上升，与试剂成分发生化学反应等。溶血对免疫透射比浊法的干扰主要来自Hb本身A值的干扰。
2. 常见受影响指标
①免疫散射比浊法类的指标：溶血样本的IgM、前白蛋白和类风湿因子（RF）的结果均低于对照样本；
②肌酐/尿酸：溶血对酶法测定肌酐/尿酸有明显的负干扰，且干扰作用随着溶血程度的加重而增大，这可能与Hb具有过氧化氢酶活性，Hb增加会消耗反应中更多的过氧化氢有关；溶血对尿素和Cys C检测无显著影响。
3. 解决方案
对于溶血，实验室可通过设置适当的副波长或采用Hb 单克隆抗体处理样本，以减少干扰。
（2）脂血对生化检测结果的影响
1. 干扰机制
发生脂浊的血清样本中含有大量的乳糜微粒和极低密度脂蛋白，其对检测结果的干扰主要是由于乳糜微粒具有光散射的特性，会产生浊度，从而影响反应的A值或使产物的颜色发生变化。
2. 常见受影响指标
分光光度比色法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法均会受脂浊的影响，且受干扰的程度与浊度相关。TG对尿素测定产生正干扰，导致检测结果被高估；对肌酐和尿酸测定产生负干扰，造成检测结果被低估；且TG浓度越高，干扰程度越显著。
3. 解决方案
高速离心法、血清稀释法、0.9%氯化钠溶液稀释法均可去除乳糜，其中通过超高速离心，吸取下层血清检测尿素、肌酐和尿酸，可降低TG的干扰，效果最好。
（3）M蛋白对生化检测结果的影响
1. 干扰机制
M蛋白是由浆细胞或B淋巴细胞单克隆恶性增殖产生的一种异常免疫球蛋白。M蛋白可在特定条件下形成沉淀，干扰分光光度比色法、比浊法和免疫学检测方法。
2. 常见受影响指标
M蛋白可对血糖、γ-谷氨酰基转移酶、总胆红素、高密度脂蛋白胆固醇、CRP、免疫球蛋白等项目以及凝血功能实验、药物检测等产生明显干扰;
3. 解决方案
样本进行预稀释，降低了M蛋白的干扰。
（4）待测浓度过高对生化检测结果的影响
1. 干扰机制
当待测物浓度过高时，免疫散射比浊法和免疫透射比浊法均可能出现检测结果假性减低，其主要原因是产生了钩状效应。样本性状、内源性干扰、等各种干扰因素是影响检测结果准确性的重要因素。
2. 常见受影响指标
RF、心型脂肪酸结合蛋白、高敏C反应蛋白及CRP的临床可见最高值可超出参考区间上限的100倍，β2-微球蛋白、RF、视黄醇结合蛋白、脂蛋白（a）浓度常超出分析测量范围上限，这些项目具有较高的发生钩状效应的风险，需引起关注。尿微量白蛋白（mAlb）浓度也经常超出分析测量上限，也应引起注意。
3. 解决方案样本进行预稀释，降低了M蛋白的干扰。
（5）药物对生化检测结果的影响
一些临床常见的药物可通过影响机体内氧化还原反应导致生化指标检测结果出现异常。例如：
1. 盐酸利多卡因
利多卡因通过血管给药后能迅速到达全身，其中10%以原体药物随尿排出，90%经肝脏细胞色素P450系统代谢为单乙基甘氨酰二甲基苯胺（MEGX）、甘氨酰二甲基苯胺和2 ，6-二甲基苯胺等产物，其中MEGX在代谢过程中会产生肌氨酸（N-甲基甘氨酸）类似物N-乙酰甘氨酸（NEG），可能会参与肌氨酸的氧化反应，生成过氧化氢，造成肌酐检测结果的假性升高。
2. 青霉素
青霉素是一种有机弱酸，进入机体后，可以释放H+，改变机体环境的pH值，当用干化学法检测尿蛋白时，酸碱指示剂产生阴离子与带阳离子的蛋白质结合生成复合物，但青霉素降低了尿液的pH值，没有达到酸碱指示剂的缓冲范围，无法引起试纸条的指示剂颜色变化，导致检测结果为假阴性。
3. 头孢替安
有些药物会产生与分析物相似的显色反应，从而影响检验结果。有研究结果显示，头孢替安会干扰干化学法测定总胆红素水平，导致检测结果升高。这是由于头孢替安的结构与胆红素相似，与总胆红素检测干片产生红色的颜色反应，导致出现假阳性的检测结果。
（1）生化检测介绍生化检测是在研究生物健康和疾病的生物化学过程变化的基础上，利用物理学、化学、生物学、病理学、免疫学、生物化学的理论与技术，通过检测生物血液、尿液、脑脊液等样本中化学物质的量与质的变化，为研究者提供疾病诊断、病情监测、疗效观察、判断预后以及健康评价等信息，最终判断被检者是否存在潜在疾病或排除某些疾病、揭示疾病变化以及药物治疗对机体生物化学过程影响的一门技术手段。
（2）生化检测原理朗伯—比尔定律待测物质溶液(均匀非散射)在一定浓度范围内对一定波长的单色平行光的吸光度与被测物质浓度和溶液厚度成正比。数学式为：A= εCLA为吸光度，C浓度，L为光径， ε为摩尔吸光系数，单位是L/mol∙cm。
朗伯比尔定律的应用需要满足几个条件：① 光线为平行光；② 光线为单色光；③ 溶液介质均匀。
生化仪器的分析方法
① 终点法：被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的变化求出被测物浓度，称为终点法。
② 两点法：在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，测定单位时间内两点的吸光度的变化率。有时也称此法为固定时间法。
③ 动力学法：一般用于酶活力的测定，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化情况，在反应速度恒定的情况下，以单位时间酶反应初速度来计算酶的活力单位。此法测酶的活力而不是酶的浓度（质量）。
二、生化检测前准备工作
（1）样本类型血清、血浆、尿液、脑脊液、全血、组织上清。
① 全血：包括血细胞和血浆的所有成分。采集全血时，收集管中必须含有抗凝剂。常用的抗凝剂有：肝素、柠檬酸钠和乙二胺乙酸酸 (EDTA)。根据不同研究需要进行选择。
② 血浆：是全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，获得的不含细胞成分的液体。含有纤维蛋白原、凝血因子等。
③ 血清：是全血未经过抗凝处理，血凝块聚缩释出的液体。其中没有纤维蛋白原和凝血因子。
收集全血于不含抗凝剂or含促凝剂的血液收集管中；室温/4℃让样本自然凝血30-60 min，期间不能摇晃或震动；4℃，2000~3000 rpm离心10 -15min。
（2）动物采血注意事项
① 小鼠的循环血量大约是72ml/kg。以25g的成年小鼠为例，它的循环血量大约为1.8ml。
② 大鼠的循环血量大约是64ml/kg。以250g的成年大鼠为例，它的循环血量大约为16ml。
③ 采集10%的循环血量之后，大约需要2周时间恢复。
④ 状况良好的小鼠一般采血量建议不超过循环血量的10%。有研究表明失血超过15%以上实验动物会发生血量减少性休克。以25g的成年小鼠为例，10%的循环血量大约是0.2ml。
（3）不同采血管的应用
（4）生化检测送样检测注意事项
1. 血常规检测（检测量全血20ul，客户准备全血50ul）
① 最好使用EDTA抗凝血剂；
② 柠檬酸盐将稀释样本，肝素将引起细胞凝集，两者都将减少计数。
2. 生化检测（检测量血清10ul/指标，客户准备血清30+（n-1）*10ul）
① 肝素化血浆或血清(无抗凝血剂)样品适用于生化检测。因为同一患者的血浆与血清的检测结果不同。所以如果需要连续监测同一患者，应使用相同的样品。血浆里含有纤维蛋白原，而血清中没有(在凝血期间移除)，因此检测结果里血浆的总蛋白(和球蛋白，因为纤维蛋白原是β球蛋白)的结果比血清高。凝血期间钾从血小板中释放，因此血清钾高于血浆钾(后者结果更准确)。
② 柠檬酸盐和EDTA抗凝剂不适用于生化检测，因为它们会螯合二价阳离子(钙，镁)并含有高浓度的钠(柠檬酸盐)或钾(EDTA)。即使是在轻度EDTA污染的血液样品中进行生化检测都会出现超高钾和超低钙的结果。一些酶的活性也需要二价阳离子。因此，在含有EDTA或柠檬酸盐做抗凝剂的血浆中，这些酶(例如碱性磷酸酶)的检查结果会虚假偏低。
3. 凝血四项（检测量血浆100ul/指标，客户准备血浆100ul/指标或全血2ml）
① 最好使用枸橼酸钠(对钙有轻度螯合作用，因此钙可以回到样本中以进行凝血筛选测定)。
② 不能使用肝素(样品不会凝结)，EDTA可以使用(钙可以回到样本中)，但不是很可靠所以不推荐使用。
（5）不同样本采集及送样要求
1. 样本采集
① 全血：取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中，轻轻颠倒混匀，充分抗凝，得到全血样本。
② 血清：取新鲜血液置于普通，室温条件下静置30 min，待血液凝结，2000rpm离心10 min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。
③ 血浆：取新鲜血液加入到盛有肝素化抗凝剂的管中，颠倒混匀，充分抗凝，1000-2000rpm离心10 min，取上层淡黄色透明液体即为血浆
2. 样本保存及运输
① 全血：血常规检测应尽量在血液采集后2h内完成，如全血标本未来得及送检，需要将标本放置于4℃以下保存一天内检测；糖化血糖蛋白检测：当天完成避免过夜；4℃运输，将样本用纸包裹起来避免直接与冰袋接触；
② 血清、血浆：生化检测尽快完成，若暂时不测定，可分装冻存备用，避免反复冻融，一般4℃可保存一周，-20℃可保存半个月，-80℃可保存一个月。特殊指标对样本有较高要求除外。4度运输；干冰运输（切记反复冻融）；
3. 凝血四项样本采集及送样要求
① 样本采集：抽取静脉血，按照9份静脉血、1份抗凝剂的比例加入到3.8%(或3.2%)的枸橼酸钠抗凝管中，轻轻颠倒10次使之充分混匀，不得有凝块，不得形成泡沫。（蓝色管）
② 样本处理：采样后应尽快分离血浆(60分钟内进行)，将标本以3000r/min离心10-15分钟，使血浆分层，取上层血浆。
③ 样本保存及运输：分离后的血浆-20℃以下密封可保存2周。干冰运输。
④ 样本用量：凝血四项单次检测样本量不可低于300ul，单项检测最好提供100ul以上，样本不可稀释。
三、生化检测结果异常分析
（1）溶血对生化检测结果的影响
1. 干扰机制
由于RBC内高浓度成分逸出，增加血浆分析物浓度；血红蛋白（Hb）浓度升高导致的光学干扰，还可以使431～555 nm波长附近的吸光度（A）值明显上升，与试剂成分发生化学反应等。溶血对免疫透射比浊法的干扰主要来自Hb本身A值的干扰。
2. 常见受影响指标
①免疫散射比浊法类的指标：溶血样本的IgM、前白蛋白和类风湿因子（RF）的结果均低于对照样本；
②肌酐/尿酸：溶血对酶法测定肌酐/尿酸有明显的负干扰，且干扰作用随着溶血程度的加重而增大，这可能与Hb具有过氧化氢酶活性，Hb增加会消耗反应中更多的过氧化氢有关；溶血对尿素和Cys C检测无显著影响。
3. 解决方案
对于溶血，实验室可通过设置适当的副波长或采用Hb 单克隆抗体处理样本，以减少干扰。
（2）脂血对生化检测结果的影响
1. 干扰机制
发生脂浊的血清样本中含有大量的乳糜微粒和极低密度脂蛋白，其对检测结果的干扰主要是由于乳糜微粒具有光散射的特性，会产生浊度，从而影响反应的A值或使产物的颜色发生变化。
2. 常见受影响指标
分光光度比色法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法均会受脂浊的影响，且受干扰的程度与浊度相关。TG对尿素测定产生正干扰，导致检测结果被高估；对肌酐和尿酸测定产生负干扰，造成检测结果被低估；且TG浓度越高，干扰程度越显著。
3. 解决方案
高速离心法、血清稀释法、0.9%氯化钠溶液稀释法均可去除乳糜，其中通过超高速离心，吸取下层血清检测尿素、肌酐和尿酸，可降低TG的干扰，效果最好。
（3）M蛋白对生化检测结果的影响
1. 干扰机制
M蛋白是由浆细胞或B淋巴细胞单克隆恶性增殖产生的一种异常免疫球蛋白。M蛋白可在特定条件下形成沉淀，干扰分光光度比色法、比浊法和免疫学检测方法。
2. 常见受影响指标
M蛋白可对血糖、γ-谷氨酰基转移酶、总胆红素、高密度脂蛋白胆固醇、CRP、免疫球蛋白等项目以及凝血功能实验、药物检测等产生明显干扰;
3. 解决方案
样本进行预稀释，降低了M蛋白的干扰。
（4）待测浓度过高对生化检测结果的影响
1. 干扰机制
当待测物浓度过高时，免疫散射比浊法和免疫透射比浊法均可能出现检测结果假性减低，其主要原因是产生了钩状效应。样本性状、内源性干扰、等各种干扰因素是影响检测结果准确性的重要因素。
2. 常见受影响指标
RF、心型脂肪酸结合蛋白、高敏C反应蛋白及CRP的临床可见最高值可超出参考区间上限的100倍，β2-微球蛋白、RF、视黄醇结合蛋白、脂蛋白（a）浓度常超出分析测量范围上限，这些项目具有较高的发生钩状效应的风险，需引起关注。尿微量白蛋白（mAlb）浓度也经常超出分析测量上限，也应引起注意。
3. 解决方案样本进行预稀释，降低了M蛋白的干扰。
（5）药物对生化检测结果的影响
一些临床常见的药物可通过影响机体内氧化还原反应导致生化指标检测结果出现异常。例如：
1. 盐酸利多卡因
利多卡因通过血管给药后能迅速到达全身，其中10%以原体药物随尿排出，90%经肝脏细胞色素P450系统代谢为单乙基甘氨酰二甲基苯胺（MEGX）、甘氨酰二甲基苯胺和2 ，6-二甲基苯胺等产物，其中MEGX在代谢过程中会产生肌氨酸（N-甲基甘氨酸）类似物N-乙酰甘氨酸（NEG），可能会参与肌氨酸的氧化反应，生成过氧化氢，造成肌酐检测结果的假性升高。
2. 青霉素
青霉素是一种有机弱酸，进入机体后，可以释放H+，改变机体环境的pH值，当用干化学法检测尿蛋白时，酸碱指示剂产生阴离子与带阳离子的蛋白质结合生成复合物，但青霉素降低了尿液的pH值，没有达到酸碱指示剂的缓冲范围，无法引起试纸条的指示剂颜色变化，导致检测结果为假阴性。
3. 头孢替安
有些药物会产生与分析物相似的显色反应，从而影响检验结果。有研究结果显示，头孢替安会干扰干化学法测定总胆红素水平，导致检测结果升高。这是由于头孢替安的结构与胆红素相似，与总胆红素检测干片产生红色的颜色反应，导致出现假阳性的检测结果。
