泛素修饰类型与靶蛋白修饰位点的鉴定

使用HA-Ub-WT/KO泛素修饰系统检测修饰类型：使用HA-Ub-WT和HA-Ub-KO（K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63）载体，分别与泛素连接酶（E3）和修饰底物共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，明确泛素连接酶对修饰底物的泛素修饰类型。或再次使用HA-Ub-WT（K6R，K11R，K27R，K29R，K33R，K48R和K63R）载体，分别与泛素连接酶（E3）和修饰底物共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，再次明确泛素连接酶对修饰底物的泛素修饰类型。
使用靶蛋白修饰位点突变鉴定修饰位点：结合生物信息学在线工具（UbPred和GPS-Uber），预测可能的泛素化位点，构建靶蛋白的位点突变体，与HA-Ub-WT质粒和E3连接酶共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，明确修饰底物的关键修饰位点。
靶蛋白修饰突变体构建验证：构建靶蛋白的泛素化位点突变体，通过比较野生型与突变体的功能差异，验证泛素化位点的功能。