第一步，筛选调控TRPML的上游分子
为了确定癌细胞中调节溶酶体胞吐的上游途径，选了一个含有644种化合物的激酶抑制剂文库进行筛选（工作量有点大），结果发现：具有抑制功能的小分子大部分是PI3K和AKT抑制剂，其中AKT抑制剂对溶酶体胞吐的抑制作用最强，活化AKT的表达则增强癌细胞中溶酶体的胞吐（图1a-c）。
第二步，确定AKT是TRPML的上游分子
过表达AKT1增加TRPML1的蛋白丰度（图1e），敲减或抑制AKT则降低TRPML1的蛋白丰度（图1f）；不影响TRPML1的mRNA表达（图1d）。表明AKT通过增加TRPML1蛋白丰度来增强溶酶体胞吐。
第三步，AKT与TRPML相互作用，磷酸化TRPML
内源性Co-IP分析显示，TRPML1与AKT相互作用（图1g）。另外，体外磷酸化实验发现，TRPML1在活性AKT激酶存在下很容易被磷酸化，而加入λ-磷酸酶(PPase)时，没有检测到这种磷酸化（图1h）。表明AKT可能通过调节其磷酸化来稳定TRPML1。
第四步，AKT磷酸化TRPML-S343位点
使用Scansite程序预测TRPML1中特定蛋白激酶的可能磷酸化位点，结合AKT保守修饰位点(RXRXXS/T，其中X为任意氨基酸)特征，推测TRPML1-S343可能是潜在的修饰位点（图1i）。结构预测该位点位于TRPML1的细胞质侧（图1j），进一步暗示TRPML1-S343可能是AKT的靶向修饰位点。体外激酶实验显示，活性AKT激酶增加TRPML1-WT蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸化量，但这种磷酸化在失活突变体TRPML1-S343A蛋白中被阻断【备注：磷酸化修饰，色氨酸（S）失活突变丙氨酸（A）；活化突变天冬氨酸（D）】（图1k）。表明AKT可以直接磷酸化TRPML1的Ser343位点。
第五步，AKT通过磷酸化TRPML1的Ser343位点来稳定TRPML1
蛋白质合成抑制剂环己亚胺(CHX)处理下，AKT抑制剂或AKT敲低加速了TRPML1的降解（图1l）。另外，在CHX处理后，磷酸化激活突变TRPML1-S343D蛋白增强了TRPML1的蛋白稳定性，而磷酸化失活突变TRPML1-S343A蛋白加速了TRPML1的降解（图1m）。
表明AKT可以通过直接磷酸化和稳定TRPML1来促进溶酶体胞吐。
图1
全文分享可查阅：【《Sci Transl Med》解读：磷酸化修饰抑制泛素化修饰！TRPML1是AKT 过度激活癌症的潜在治疗靶点】。
如有相关科研问题，欢迎共同探讨。
